«Отключить» клетки ВИЧ, поменять цвет глаз, стать супергероем: что можно и нельзя сделать с помощью геномного редактирования?

Отредактируй меня полностью

Вы знали, что бактерии научили людей редактировать геном? И многое, о чем мы писали до этого и будем обсуждать в этой главе, заслуга бактерий. Звучит невероятно, но так и есть.

• Технологии геномного редактирования — это группа технологий, которые дают ученым возможность изменять ДНК организма. Эти технологии позволяют добавлять, удалять или изменять генетический материал в определенных местах генома.

Ученые разработали несколько методов для редактирования генома. Самый известный сегодня метод — CRISPR/Cas9. Его позаимствовали из естественной системы редактирования генома бактерий. Бактерии захватывают фрагменты ДНК от вторгающихся вирусов и используют их для создания сегментов ДНК, известных как массивы CRISPR.

Массивы CRISPR позволяют бактериям «запоминать» вирусы. Если вирусы атакуют снова, бактерии производят сегменты РНК из массивов CRISPR для нацеливания на ДНК вирусов. Затем бактерии используют Cas9 или аналогичный фермент, чтобы разрезать ДНК, что отключает вирус. Система CRISPR/Cas9 работает аналогичным образом в лаборатории. Исследователи создают небольшой фрагмент РНК с короткой «направляющей» последовательностью, которая прикрепляется к определенной последовательности-мишени ДНК в геноме. РНК также связывается с ферментом Cas9. Как и у бактерий, модифицированная РНК используется для распознавания последовательности ДНК, а фермент Cas9 разрезает ДНК в целевом месте. После того как ДНК разрезана, исследователи используют собственный механизм восстановления ДНК клетки, чтобы добавлять или удалять фрагменты генетического материала или вносить изменения в ДНК.

Технология геномного редактирования представляет большой интерес для профилактики и лечения заболеваний человека. В настоящее время большинство исследований по редактированию генома проводится для понимания болезней с использованием моделей клеток и животных. Ученые все еще работают над тем, чтобы определить, является ли этот подход безопасным и эффективным применительно к людям. Он изучается в исследованиях по широкому кругу заболеваний, включая такие моногенные расстройства, как муковисцидоз, гемофилия и серповидноклеточная анемия. В перспективе рассматривается лечение и профилактика более сложных заболеваний: рака, болезней сердца, психических заболеваний и инфекции ВИЧ.

Этические проблемы возникают, когда редактирование генома с использованием таких технологий, как CRISPR/Cas9, используется для изменения генома человека. Большинство изменений, которые вносятся при редактировании генома, ограничены соматическими клетками, отличными от яйцеклеток и сперматозоидов. Эти изменения затрагивают только определенные ткани и не передаются из поколения в поколение. Однако изменения, внесенные в гены в яйцеклетках, сперматозоидах или в генах эмбриона, могут передаться будущим поколениям. Редактирование клеток зародышевой линии и генома эмбриона поднимает ряд этических проблем, включая вопрос о том, допустимо ли использовать эту технологию для улучшения нормальных человеческих качеств (таких как рост или интеллект). Исходя из  этических соображений и требований безопасности, редактирование геномных клеток и эмбрионального генома в настоящее время запрещено во многих странах.

Отредактировать геном и избавиться от всех болезней

В 2018 году, когда родился мой блог, я стала еще больше интересоваться технологией CRISPR/Cas9 и лечением различных заболеваний с ее помощью. До 2016 года технологию CRISPR/Cas9 испытывали для лечения бета-талассемии на эмбрионах. А в 2018 году произошло то, что потрясло всех, не только генетиков и биологов, но и людей, далеких от науки.

В Китае с помощью ЭКО на свет появились близнецы Лулу и Нана. Что в них необычного? Это первые в мире генетически модифицированные дети. Китайский ученый Цзянькуй Хэ рассказал о рождении первых в мире детей из генетически отредактированных эмбрионов. По словам ученого, родились близняшки, у которых он хотел создать устойчивость к заражению ВИЧ. В своем эксперименте он пытался изменить ген CCR5, который кодирует белок, позволяющий ВИЧ проникнуть в клетку, используя метод редактирования CRISPR/Cas9. Он хотел создать у младенцев иммунитет к ВИЧ, носителем которого был их отец. Мать при этом была здорова. Всего ученому удалось отредактировать 16 из 22 эмбрионов, 11 из которых использовались в шести попытках, — одна закончилась беременностью и родами .

По словам Хэ, у одной из девочек отредактированы обе копии нужного гена, а у второй — одна копия, свидетельств повреждения других генов он не нашел. Хэ Цзянькуя и двоих его коллег признали виновными в том, что они нарушили китайское законодательство и умышленно, «в погоне за славой» нарушили порядок проведения медицинских процедур, хотя я думаю, что вряд ли они думали о «славе». Хэ приговорили к трем годам тюрьмы и назначили штраф.

До сих пор этот случай обсуждают повсюду. Эта тема будоражит ум. Только представьте, что геном человека можно отредактировать. Сразу в голове возникает целый ряд мыслей о супергероях, сверхспособностях и людях-мутантах. Но в реальности все намного прозаичнее. Мутация в одном и даже в двух генах не превратит человека в супергероя, а лишь изменит какое-то определенное свойство, за которое отвечает этот ген.

Что творят с ВИЧ?

До недавнего времени у человека, который заразился вирусом иммунодефицита, был лишь один вариант терапии — всю жизнь принимать антиретровирусные препараты, чтобы сдержать инфекцию. В 2017 году Лэй Сюй (Lei Xu) из Центра исследований стволовых клеток Пекинского университета и его коллеги провели клиническое исследование, чтобы попробовать создать устойчивость к ВИЧ в клетках крови с помощью CRISPR/Cas9.

Исследователи взаимодействовали с 27-летним пациентом, у которого кроме ВИЧ-инфекции диагностировали еще и Т-клеточную лейкемию. По плану его должны были лечить лучевой терапией, которая убивает существенную часть клеток крови, и пересадка кроветворных клеток ему понадобилась бы в любом случае. Ученые решили совместить лечение с экспериментальной процедурой: после облучения они ввели больному уже отредактированные клетки донора с мутацией в гене CCR5. В этот момент антиретровирусную терапию пришлось прервать, чтобы можно было оценить результат эксперимента.

CRISPR-модифицированные клетки прижились в организме и не вызвали острого отторжения. Через 19 месяцев клетки с мутацией в гене CCR5 все еще можно было найти в крови пациента, причем не только Т-лимфоциты, но и другие клетки крови. Это значит, что отредактированные кроветворные клетки работают полноценно и производят разные типы клеток, у которых мутация сохраняется.

Тем не менее окончательно отредактировать кроветворение пациента не удалось. Среди всех клеток, забранных учеными у пациента для редактирования, внести изменения в геном получилось лишь у 17,8%. После возвращения в организм новые клетки начали конкурировать со старыми за заселение красного костного мозга. И в течение всего времени наблюдения они составляли лишь 5–8% от общей кроветворной популяции. Сделать пациента устойчивым к вирусу не удалось: после отмены ретровирусной терапии количество вирусной РНК в крови начало расти, и ему пришлось снова назначить лечение, чтобы инфекция не прогрессировала.

Вместе с тем авторы работы отмечают, что у их исследования есть и позитивный результат. Этот эксперимент сегодня является самым долгим наблюдением за CRISPR-отредактированными клетками в организме человека, и оно показывает, что такие клетки могут быть безопасны. Ученые не обнаружили в клетках никаких незапланированных изменений (следов нецелевого редактирования генома). Клетки также не превратились и в опухолевые, о чем предупреждали некоторые ученые в 2018 году. Таким образом, китайское исследование показало, что CRISPR-модифицированные клетки можно использовать в терапевтических целях без риска для пациента.

• Мутация CCR5Δ32 делает Т-клетки человека устойчивыми к заражению ВИЧ. Пересадка костного мозга от донора с мутацией может спасти больного от инфекции, как это было в случае с «берлинским пациентом», а потом с «лондонским», «пациентом города Надежды» и, возможно, «дюссельдорфским». Однако в Европе носителей этой мутации всего несколько процентов от населения, и подобрать полностью совместимого донора довольно сложно. А в некоторых странах (например, в Китае), где носителей практически нет, это и вовсе превращается в невыполнимую задачу.

Еще в 2007 году выяснилось, что есть путь избавления от ВИЧ — приобрести устойчивость вместе с чужими лимфоцитами. Пациенту по имени Тимоти Рэй Браун, которого знают как «берлинского пациента», пересадили кроветворные стволовые клетки от донора с мутацией CCR5Δ32, а через три года оказалось, что ВИЧ в организме Брауна больше нет. В 2020 году Браун умер от лейкемии. В марте 2019 года врачи сообщили, что еще один пациент, вероятно, повторил судьбу Тимоти Брауна: его окрестили «лондонским пациентом». Врачи не обнаружили следов ВИЧ в организме пациента в течение более 30 месяцев после пересадки костного мозга. В том же году исследователи сообщили о третьем, «дюссельдорфском», пациенте с ВИЧ и ремиссией после пересадки костного мозга. В начале 2022 года жительница Нью-Йорка вылечилась от ВИЧ после трансплантации стволовых клеток из пуповинной крови, которая не требует полного генетического совпадения, но имеет мутацию в гене CCR5. Как и у предыдущих пациентов, помимо ВИЧ врачи нашли у нее миеловидный лейкоз, иначе — рак кроветворных клеток костного мозга.

Ножницы против

В 2019 году представители компаний CRISPR Therapeutics и Vertex объявили о первом успешном применения CRISPR для лечения наследственных заболеваний. Экспериментальная методика помогла двум пациенткам, одна из которых страдает от бета-талассемии, а другая — от серповидноклеточной анемии. В первой половине 2019 года CRISPR Therapeutics и Vertex для старта клинических испытаний CRISPR-терапии начали набирать в Европе и США добровольцев с наследственными заболеваниями крови. Среди них были две женщины из Германии и США. Хотя их болезни отличаются, обе они связаны с мутациями в гене гемоглобина. При бета-талассемии развивается дефицит эритроцитов, а при серповидноклеточной анемии они приобретают неправильную форму и могут застревать в капиллярах.

Для лечения обеих пациенток исследователи применили один подход. Клетки крови извлекли и отредактировали таким образом, чтобы они вновь начали производить фетальный гемоглобин, который обычно синтезируется только у детей. Для этого с помощью CRISPR «отредактировали» ген, подавляющий производство «детского» гемоглобина у взрослых людей. Затем при помощи химиотерапии уничтожили старые клетки крови в костном мозге пациенток, а на их место ввели отредактированные. 

Процедура значительно облегчила состояние женщин. Например, пациентка с бета-талассемией после лечения смогла несколько месяцев обходиться без переливания донорской крови. До редактирования ей приходилось делать это 16 раз в год и более. Теперь 99,8% клеток ее крови производили фетальный гемоглобин. У пациентки с серповидноклеточной анемией до лечения сосуды закупоривались дефектными эритроцитами в среднем семь раз в год. Однако в течение четырех месяцев после лечения такого не произошло ни разу: 46,6% гемоглобина в ее крови относилось к фетальной форме.  Оба случая сопровождались довольно тяжелыми побочными эффектами, включая воспаление легких, боли в животе и образование желчных камней. Исследователи полагают, что это последствия химиотерапии, а не CRISPR. К июню 2020 года лечение прошли еще несколько человек, и все достигли значимых улучшений.

У новых добровольцев ученые также наблюдали успешное приживление отредактированных клеток, они эффективно продуцировали эритроциты после их трансплантации обратно пациенту. У некоторых участников, как и в случае первых двух пациентов, исследователи зафиксировали побочные эффекты, однако их связывают с проведением обязательного курса химиотерапии перед трансплантацией модифицированных клеток . В конце 2020 года израильские ученые продемонстрировали эффективность технологии генного редактирования CRISPR/Cas9 в лечении метастатического рака. Они разработали новую систему доставки на основе липидных наночастиц, которая воздействует на раковые клетки и разрушает их воздействием на гены.

Для того чтобы изучить эффективность применения этой технологии для лечения рака, профессор Пеер и его команда выбрали два вида рака из самых смертельных: глиобластому и метастатический рак яичников. 

• Глиобластома — наиболее агрессивный тип рака мозга, ожидаемая продолжительность жизни при котором составляет 15 месяцев после постановки диагноза, а выживаемость на протяжении пяти лет — всего лишь 3%.
• Рак яичников — частая причина смерти среди женщин и самый летальный вид рака женской репродуктивной системы. У большинства пациентов заболевания диагностируются на поздней стадии, когда метастазы уже распространились по организму. Несмотря на прогресс в этой области, такой рак побеждает всего треть пациентов.

Ученые продемонстрировали, что всего одна процедура терапии липидными наночастицами и CRISPR удваивает среднюю продолжительность жизни у мышей с глиобластомой, увеличивая шансы на выживание до 30%. Лечение метастатического рака яичников повысило выживаемость грызунов до 80%. Исследователи отмечают, что такие результаты при лечении этих двух агрессивных видов рака открывают множество новых возможностей для использования технологии при борьбе с другими видами рака. В 2020 году технология получила особое признание, нобелевскими лауреатами по химии стали Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье. Премию присудили за развитие метода редактирования генома CRISPR/Cas9.

Однако наука не стоит на месте, и в мае 2021 года исследователи из Гарвардского института создали новый инструмент редактирования генов, который может позволить ученым проводить миллионы генетических экспериментов одновременно. Они назвали этот метод рекомбинированием ретронов, в нем используются сегменты бактериальной ДНК, которые могут создавать фрагменты одноцепочечной ДНК.

Этот метод основан на защитном механизме бактерий — ретронах.

• Ретрон — это небольшой фрагмент одноцепочечной ДНК, который обоими концами прикреплен к фрагменту РНК. Такая молекула получается в результате считывания ДНК с матрицы РНК (обратной транскрипции) при помощи ретротранскриптазы. 

Главное потенциальное применение геномного редактирования с использованием ретронов — внесение небольших мутаций. Такой подход можно использовать, например, для создания большого количества генетических вариантов, чтобы имитировать их влияние на приспособленность и эволюцию. Чтобы имитировать эволюцию каждого варианта из одного генома, биологи предложили фрагментировать этот геном и поместить фрагменты в ретроны, после чего внести каждый вариант в отдельную клетку. Ученые провели такой эксперимент на кишечной палочке и показали, что в ее геноме действительно можно выделить мутации, которые дают преимущество в ходе эволюции — устойчивость к антибиотикам.

Эпигенетический редактор

Мы уже выяснили, что изменение последовательности ДНК — очень полезный механизм для лечения некоторых заболеваний, которые не поддаются стандартной терапии. Однако не все так просто. Все мы несовершенны, как и система редактирования генов CRISPR/Cas9. Иногда при работе она задевала важные участки ДНК клеток, что приводило к ошибкам при их последующем делении.

Доценты Калифорнийского университета Люк Гилберт, Вайсман Джеймс Нуньес и их команда разработали новый метод, который вызывает стабильные изменения активности генов, чтобы его можно было наследовать через сотни клеточных делений, а также является полностью обратимым! Его назвали CRISPRoff, и он способен отключать гены без повреждения нитей ДНК, а значит, и без генетических трансформаций материала!

Изменения, сделанные с помощью новой технологии, передаются следующим поколениям клеток, и самое главное — их можно отменить в любой момент. Описать такой механизм можно словом «эпигенетический», что означает дословно «над генами». Изменения при нем происходят не в процессе редактирования структуры кода. С помощью химических превращений удается регулировать степень активности, а не последовательность нуклеотидов в ДНК. Эпигенетическое отключение генов останавливает считывание кода с ДНК и синтез патологических белков, а значит, может препятствовать развитию заболеваний. Как и любая новая технология, метод требует более тщательного изучения.

Человек с сердцем свиньи

Сегодня генная инженерия зашла настолько далеко, что 57-летнему пациенту с неизлечимой болезнью сердца сделали пересадку этого органа, который взяли у свиньи и генетически отредактировали! Такая манипуляция была последним шансом Дэвида Беннета на жизнь: он уже перенес несколько пересадок клапанов сердца, а пересадить сердце от человеческого донора по неуточненным причинам было невозможно. Случай небывалый: только в конце 2021 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США разрешило провести экстренную операцию, которая длилась восемь часов. После операции Дэвид находился на искусственном кровообращении, что нормально для послеоперационного периода, но вскоре его отключили, так как новое сердце прекрасно выполняло свои функции. Врачи отметили, что не наблюдается признаков эндогенного ретровируса свиньи, что возможно при трансплантации органов не от человека.

Вообще, ксенотрансплантация известна еще с 60-х годов прошлого столетия. Тогда пересаживали почки шимпанзе нескольким людям, но реципиентам удавалось прожить не более девяти месяцев после операции. Также известны попытки пересадки сердца бабуина младенцу, родившемуся с дефектом этого органа. Но тогда, в 80-х годах, операция продлила жизнь ребенка всего на 20 дней. Считается, что если брать органы свиней в качестве донорских, то успех операции значительно повышается. В наши дни людям, страдающим диабетом, пересаживают клапаны сердца и клетки поджелудочной железы, которые берут у свиней. Генетическая модификация ксенотрансплантатов нужна для того, чтобы снизить риск отторжения тканей.

• Сердце, которое пересадили Беннету, прошло 10 генетических модификаций: ученые отключили четыре гена, среди которых был ответственный за отторжение чужеродной ткани. А еще шесть генов, наоборот, добавили, что сделало орган более толерантным к иммунной системе Дэвида. Но надежды полностью не оправдались: пациент все равно умер спустя два месяца после операции, правда, до сих пор неясно из-за чего. Видимо, предстоит еще выяснить много нюансов, прежде чем технологию возьмут в оборот. 

Выключить алкоголизм

По всему миру проблема излечения от алкоголизма становится все более актуальной: время идет, а лекарство для 100%-ного исцеления до сих пор не найдено. Ученые из США, Университета штата Иллинойс, открыли как применить особую технологию редактирования генов CRISPR-dCas9 для работы в этом направлении.

При развитии алкоголизма в возрасте от 11 до 17 лет уменьшается экспрессия гена ARC. Этот ген связан со способностью обучаться и запоминать новую информацию, а также за передачу РНК от нейрона к нейрону. В одном из экспериментов участвовали лабораторные крысы, у которых были подобные изменения. С помощью редактирования конкретно этого гена крысам удалось вернуть свою трезвую жизнь. Результаты эксперимента все-таки довольно узки: он показал, что можно вылечить алкоголизм у той группы грызунов, зависимость которых пришлась на подростковый период. На людях такие эксперименты не проводились.

Теперь перейдем к братьям нашим меньшим. Домашние животные — следствие искусственного отбора, направленного на то, чтобы животное соответствовало нуждам хозяев. Популярное домашнее животное хомяк не всегда отличается кротким нравом и добродушием. По крайней мере, так считали ученые из США, которые решили подредактировать геном хомяка и сделать его более дружелюбным. Но получилось все наоборот. С помощью технологии редактирования генома ученые собирались выключить ген, который связан с проявлением агрессивного поведения, путем подавления активирующих его рецепторов вазопрессина — гормона, связанного у людей с чрезмерной агрессией. Но все оказалось не так однозначно: подобная коррекция привела к еще большей агрессии и усилила инстинкты самозащиты. Что же, ученым пришлось признать, что психическая регуляция сложнее, чем предполагалось.

Выключить цвет

Изучать воздействие генной терапии в некоторых экспериментах требуется на стадии эмбриона. Но иногда невозможно внести белок — переносчик гена непосредственно в эмбрион. Например, насекомые развиваются в очень плотной оболочке. Однако недавно японские ученые нашли способ доставить CRISPR-коктейль в половые клетки. Группа ученых придумала поместить переносчик опосредованно — в тело материнской особи. Там он проникает в половые клетки и наследуется потомством. Новый подход назвали DIPA-CRISPR, или прямой родительский CRISPR. С помощью такого подхода ученым удалось изменить цвет глаз у 22% потомства рыжих тараканов и у 50% потомства жуков-хрущаков. Похожие результаты получались и другими методами. Главное, что подход сработал!